دپلیمریزاسیون شیمیایی

 

از آنجا که کوتین عمدتا پلی استر است، با برش باندهای استری می توان مونومرها را آزاد نمود. روش­های معمول مورد استفاده عبارتند ازهیدرولیز قلیایی، تبادل استری با متانول حاوی boron trifluoride یا سدیم متوکسید، برش کاهشی با LiAlH4 یا Li­­AlD4 در تتراهیدروفوران و یا با تری متیل لیزیل یدید در حلال های آلی. عملکرد این روش یا مشتقات آنها در این روش براساس روش دپلیمرازیسیون است.
کوتین می تواند شامل گروه های functional از قبیل اپوکسیدها و آلدئیدها باشد که به روش دپلیمرازیسیون پایدار نیستند در طول دپلیمریزاسیون چنین گروه های عملکردی ممکن است به مشتقاتی تبدیل شوند که برای شناسایی گروه های عملکردی پلیمر ممکن است مفید باشد. به عنوان مثال، در طول depolymerization کاهشی با LiAlD4، اپوکسید و آلدهید ومشتقات D-labeled تولید می­ شود. پس از آن طیف سنجی جرمی می تواند به راحتی این مارکر را در تولیدات کاهشی ردیابی کند و در نتیجه اپوکسی یا oxo در پلیمر اولیه شناسایی می­ شود.

 

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.

 

دپلیمریزاسیون آنزیمی

 

از آنجایی که اکثر مونومرها توسط پیوندهای به هم می چسبند، استراز ها می توانند این پلیمر را بشکنند. لیپاز پانکراس می تواند کوتین را تجزیه کرده، در نتیجه الیگومرها و مونومرها آزاد می شوند. مدارک و شواهد ارائه شده نشان داده است که نمک های صفراوی آنزیم را در سطح پلیمر نامحلول تثبیت می­ کند. همچنین تعامل سطح پلیمر با سیستم lipase±colipase±bile salt مشابه با مشاهدات با تریگلیسرید است. در میکروارگانیسم هایی مانند قارچ و باکتری ترکیب پلی استر هیدرولازی لیپازی و کوتیناز یک پلی استر خاص تکامل یافته است. اولین کوتینازی که تخلیص و شناسایی شد کوتیناز قارچی بود. این آنزیم نشان داد که الیگومرها و مونومرها را آزاد می کند. پس از عملکرد کوتیناز ترجیحا استر الکل اولیه رها می شود و الیگومر انزیمی جدا شده برای مطالعات ساختاری مناسب است که دارای اتصالات متقاطع با باندهای استر الکل های ثانویه است.

 

مونومرهای تشکیل دهنده کوتین

 

مونومرهایی که به وسیله ی روش دپلیمریزاسیون شیمیایی تولید می­شوند را می توان به وسیله ی کروماتوگرافی (TLC ) در ژل سلیکا جداسازی نمود و دسته­های مختلف (بسته به نوع و پلاریته انها) مانند هیدروکسی- دی هیدروکسی – تری هیدروکسی و مشتقات اسید های چرب را از هم تفکیک نمود. انتخاب سیستم های حلال بسته به روش های دپلیمریزاسیون که استفاده می شود متفاوت است. باندهای جدا شده توسط TLC پس از ساخت مشتقات مناسب از آنها وارد سیستم (gas-liquid chromatography/mass spectrometry(GC/MS می­گردند.
شکست هیدروژنولیتیک با LiAlD4 تولید مونومر را کاهش می دهد که می تواند قبل ازGC/MS تری متیل سیلیته شود.
اگر از یک روش هیدرولیتیک استفاده شود هر دو گروه کربوکسیل و گروه هیدروکسیل نیاز دارند که مشتق شوند. هرچند که تری متیل سیلاسیون مشتقات گروه های کربوکسیل و هیدروکسیل ، مشتقات trimethylsilyl (TMSi) از متیل استرها گروه­های جدا شده را بهتر تشخیص می دهد. با این حال طیف سنجی جرمی برای شناسایی مطمئن از ساختار مونومر لازم است. از این رو GC/MS یک روش انتخابی برای تعیین ساختار و ترکیب مونومرها می­باشد. معمولا مخلوط مونومر بدست امده توسط یکی از روش های دپلیمریزاسیون می تواند مشتق شود و به طور مستقیم توسط ترکیبGC/MS مورد تجزیه و تحلیل قرار گیرد.
نتایج بدست امده از تجزیه و تحلیل انجام شده روی کوتین بسیاری از گیاهان نشان داده که این پلی استر گیاهی عمدتا از مونومرهای خانواده های c16 و c18 تشکیل شده است. اجزا اصلی و رایج از خانوادهc16 از مونومرها hydroxyhexadecanoic acid -16 و dihydroxyhexadecanoic acid16 و۱۰ است. این دی هیدروکسی اسید معمولا جز غالب است و معمولا مخلوطی از ایزومرهای موقعیتی با طول متوسط زنجیره وجود دارد. در برخی موارد مشتقات دیگر C-16 می تواند قابل توجه یا عمده ترین جزء باشد. برای مثال-oxo-C16 acid 10-hydroxy-16 در کوتین مرکبات و oxo-9-16 یا acid 10-hydroxy-C16در برگ های بسیار جوان یا شاخه های جنینی باقلا (Vicia faba ) از اجزای اصلی تشکیل دهنده کوتین می­باشد. در برخی موارد (به ویژه گیاهان پست) مونومر c16 از قبیل hexadecanetriol 1,8,16- که یکی از اجزاء مهم است.

 

 

  •  
    1. آنزیم

 

آنزیم­ها مولکول­های‌ پروتئینی‌ بزرگی‌ هستند که‌ به‌ شکل کاتالیزور در‌ واکنش­های‌ وابسته‌ به‌ هم در‌ داخل‌ ‌ سلول‌ زنده ‌دخالت‌ می­ کنند. در ساختمان‌ بعضی‌ از آنزیم ها مواد غیر پروتئینی‌ به‌ نام‌ گروه‌ پروستتیک[۷] شرکت‌ دارند. برای‌ هر فعل‌ و انفعال‌ شیمیایی‌ که‌ در یک‌ سلول‌ رخ‌ می‌دهد آنزیم‌ ویژه‌ای‌ وجود دارد که ‌کاتالیزور آن‌ واکنش‌ به‌ حساب‌ می‌آید. تولید هر آنزیم‌ بخصوص‌ بوسیله‌ یک‌ یا چند ژن‌ موجود در مواد ژنتیکی‌ کنترل‌ می‌شود اما آخرین‌ مراحل‌ تولید آنها بوسیله‌ m-RNA و ریبوزوم ‌ها با کمک‌ مولکول­های‌ آنزیم‌ ویژه‌ و مناسب‌ انجام ‌می­گیرد. آنزیم­ها به‌ عنوان‌ کاتالیزور در واکنش­های‌ مربوط به‌ تبدیل‌ یک‌ مولکول‌ به‌ مولکول‌ دیگر از طریق‌ تغییر محل‌ دادن ‌یک‌ اتم‌ و یا یک‌ رادیکال‌ نقش‌ مهمی‌ را بازی‌ می‌کنند.
آنزیم­ها می­توانند تا یک میلیون بار سرعت واکنش­ها را زیاد ­کنند. این واکنش ها از لحاظ نظری برگشت پذیرند و باید به تعادل برسند. آنزیم­ها واکنش­ها را در جهت چپ و راست به طور یکسان تحت تاثیر قرار می­ دهند به طوری که حالت پایدار تغییر نکرده ولی سرعت واکنش زیاد می­ شود. هر سلول زنده حاوی صدها آنزیم است و فقط در صورتی می تواند عملکرد مفیدی داشته باشد که این عمل به طور مناسبی هدایت شود.
انواع‌ آنزیم ها بر اساس‌ عملکردشان‌ به شش گروه تقسیم می­شوند:

 

 

    1. اکسیدوریداکتازها[۸]: آنزیم­‌های‌ شرکت‌ کننده‌ در واکنش­های‌ اکسیداسیون‌ و احیا‌ بوده‌ و درانتقال‌ الکترون‌ از ماده‌ اکسید شونده‌ به‌ ماده‌ احیا شونده‌ نقش‌ دارند.

 

    1. هیدرولازها[۹]: آنزیم­ هایی‌ که‌ با افزودن‌ یک‌ مولکول‌ آب‌ اتصال­های‌ استری‌، گلوکوزیدی‌ و… را می‌شکنند.

 

    1. لیازها[۱۰]: آنزیم­ هایی‌ که‌ با شکستن‌ باندهای‌ C-N یا C-O یا C-C عمل‌ تجزیه کنندگی‌ دارند.

 

    1. ترانسفرازها[۱۱]: آنزیم­ هایی‌ که‌ با انتقال‌ یک‌ گروه‌ از یک‌ مولکول‌ به‌ مولکول‌ دیگر عمل‌ کاتالیزوری‌ خود را انجام‌ می‌دهند.

 

    1. ایزومرازها[۱۲]: آنزیم­ هایی‌ که‌ عمل‌ تغییر محل گروه­ها را در داخل‌ یک‌ مولکول‌ انجام‌ می‌دهند.

 

  1. لیگازها[۱۳] : آنزیم‌­هایی‌ که‌ با کمک‌ انرژی‌ آزاد شده‌ در نتیجه‌ شکستن‌ باند فسفات های‌ پر انرژی‌، اتصال‌ دو مولکول‌ را انجام‌ می‌دهند.

 

در بین‌ آنزیم­ های‌ فوق‌ الذکر، هیدرولازهایی مانند کوتیناز، مهمترین‌ آنزیم­ هایی‌ هستند که‌ در ایجاد بیماری‌ به‌ وسیله‌ آفات‌ گیاهی ‌شرکت‌ دارند، این آنزیم کوتین را تجزیه می­ کند، کوتین نقش کلیدی در محافظت از گیاهان در برابر ورود پاتوژن های بیماریزا دارد و تخریب آنزیمی آن اولین گام در روند آلودگی است.

 

آنزیم کوتیناز

 

کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه می­ کند (شکل۲-۵)، کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی­استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته­اند [۱۳]. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 هستند و حاوی یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. باندهای استری در کوتین غالب هستند اگرچه پل های پراکسید و اتصالات اتری نیز مشاهده شده است.کوتین نقش کلیدی در محافظت از گیاهان در برابر ورود پاتوژن های بیماریزا دارد و تخریب آنزیمی آن اولین گام در روند آلودگی است.

شکل ‏۲‑۵ a) توالی پروتئینی آنزیم کوتیناز b) مکانیسم عمل آنزیم کوتیناز [۱۴]
بسیاری از میکروارگانیسم­ها روی مواد پلیمری به عنوان تنها منبع کربن خود رشد می­ کنند [۱۵]. استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسم­ها مستلزم ترشح آنزیم­ های هیدرولازی است. اگرچه هنوز مشخص نیست که چگونه یک پلیمر می تواند وارد سلول شود و باعث تولید آنزیم­ های هیدرولازی شود یک احتمال این است که میکروب­ها یک سطح پایه ای از چندین آنزیم هیدرولازی ترشح می­ کنند و سپس محصولات هیدرولیز شده وارد سلول می­شوند وسنتز آنزیم ها را القا می­ کنند.
آنزیم کوتیناز از منابع مختلف (گرده [۱۶] و به طور عمده قارچ [۱۷]) تخلیص و جداسازی می­ شود. مدارک و شواهد نشان داده که کوتیناز توسط phyllospheric fluorescent Pseudomonas putida strain ، cohabiting با باکتری تثبیت کننده نیتروژن[۱۴] نیز تولید شده است [۱۸].
حمله به گیاهان توسط قارچ phytopatogenic بر اساس ترشح کوتیناز خارج سلولی است و Ascochyta rabiei، عامل سوختگی Ascochyta در گیاه نخود یک کوتیناز خارج سلولی را ترشح می­ کند که حداکثر فعالیت را در حدود pH حدود ۸ نشان می دهد [۱۹]. مطالعات نشان می­دهد که بیان کوتیناز از بوتری تیس در طول آلودگی برگ های گوجه فرنگی در مراحل اولیه الودگی کم است و هنگامی که قارچ­ها در برگ ساکن شوند و شروع به اسپورزایی کنند بیان کوتیناز زیاد می­ شود[۲۰] همچنین بیان این آنزیم در گل ژربرا[۱۵] و میوه گوجه­ فرنگی مورد مطالعه قرار گرفته است [۲۱]. کوتیناز در جوانه زنی Erysiphe graminis f. sp. hordei conidia اهمیت داشته و به خصوص در تشکیل لوله جوانه مجاور و نفوذ به کوتیکول میزبان اهمیت ویژه­ای دارد [۲۲].
مطالعات نشان داده است که می توان با بهره گرفتن از مهارکننده­ها از نفوذ قارچ­ها به گیاهان و در نتیجه از آلودگی جلوگیری کرد [۲۳]. از انجایی که کوتیناز نقش مهمی در بیماریزایی دارد، مطالعات متعددی برای تعیین خواص فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی آن انجام شده است [۲۴]. کوتینازها سرین هیدرولازهای خاصی برای استر الکل های اولیه هستند[۲۴]. امروزه بیشترین مطالعات روی قارچ فوزاریوم[۱۶] نخودفرنگی انجام شده است [۱۵]. تولید کوتیناز توسط بسیاری از شرایط رشد تنظیم می­ شود. تولید این آنزیم توسط گلوکز سرکوب می­ شود[۲۵] و توسط کوتین هیدرولیز شده یا اجزای اصلی تشکیل دهنده آن ۱۶-هیدروکسی هگزانوئیک اسید و ۱۰,۱۶ دی هیدروکسی هگزانوئیک اسید و ۹,۱۰,۱۸- تری هیدروکسی پالمیتیک اسید القا می شود [۲۶]. گروه هیدروکسیل در موقعیت امگا مهمترین عامل برای القای فعالیت است [۲۴]. درک چگونگی تنظیم اسیدهای چرب هیدروکسی در بیان ژن کوتیناز به وسیله اطلاع از ساختار ژن کوتیناز و مناطق flanking تسهیل شد [۲۷]. به منظور درک مولکولی این تنظیم ژن، عناصر عملکردی در پروموتور کوتیناز و فاکتورهای رونویسی متصل در این قسمت ­ها مورد مطالعه قرار گرفته اند [۲۵].

 

کلون و بیان کوتیناز

 

ساختار اولیه کوتیناز از cDNA کوتیناز جدا شده از قارچ Fusarium solani f. pisiتعیین شد [۲۸]. آنالیز توالی کوتیناز نشان داد که mRNA کوتیناز شامل ۱۰۵۰ نوکلئوتید است. مطالعات دیگری هم از کلون ژن کوتیناز قارچ فوزاریوم سولانی در وکتور ۳۵ انجام و گزارش شده است [۲۹].
با توجه به اهمیت کاربردهای کوتیناز ، این آنزیم در میزبان­های هترولوگوس کلون و بیان شده است. کتابخانه cDNA قارچ فوزاریوم سولانی که حاوی ژن کوتیناز می باشد [۳۰] بر مبنای کار Soliday و همکاران در سال ۱۹۸۴ ساخته شد. cDNA با کل ناحیه ی کدینگ کوتیناز به پلاسمیدpUC19 انتقال داده شد و تعیین توالی شد. ژن کلون شده بعد از سیگنال پپتید از آلکالین فسفاتاز به منظور هدایت کوتیناز به پری پلاسم E.coli بیان شد. فرض اولیه این بود که گلایسین در موقعیت ۳۲ در محصول ترجمه اولیه کوتیناز متناسب با رزیدویN ترمینال کوتیناز نهایی است. تلفیقی از سیگنال phoA با گلیسین ۳۲ منجر به ایجاد یک مکان پردازش غیرمعمول شد، بنابراین به منظور ایجاد یک سایت برشی احتمالی پروکاریوتی، ۱۶ باقی مانده­های اولیه پری کوتیناز توسط سیگنال phoA جایگزین شد و همزمان Leu-17 به وسیله آلانین جایگزین شد. تلفیقی از توالی­ها برای phoA و کوتیناز توسط جهش الیگونوکلئوتیدی جهت­دار تنها با بهره گرفتن از پلاسمید نوع pMa/c انجام شد. در نتیجه در وکتور pMa/c5-CUF، ژن phoA/cutinase تحت کنترل رونویسی پروموتور Ptac القاپذیر با IPTG قرار گرفت. سویه ی E. coli WK6 به عنوان اولین میزبان برای بیان استفاده شد. در این شرایط میزان بالایی از کوتیناز سنتز شد و با توجه به موقعیت پری­پلاسمیک کوتیناز ساخته شده، از این طریق میزان زیادی از کوتیناز برای تعیین ساختار آن فراهم شد. کوتیناز نوترکیب می­توانست به­راحتی در مقادیر زیاد تولید و تخلیص شود [۳۰].
اخیرا یک سیستم تولید موثر برای کوتیناز در قارچ فوزاریوم سولانی در ساکرومایسیس ایجاد شده که علت آن این است که مخمر قادر به انجام تغییرات پس از ترجمه است که برای فعالیت بیولوژیکی پروتئین کامل مهم است همچنین جهش­های نقطه ای برای بهینه سازی فعالیت لیپازی در ژن کوتیناز مطرح شده است [۳۱]. پپتید سیگنال اولیه کوتیناز به وسیله پپتید مخمر β-D-fructofuranosidase جایگزین شد و ژن در پلاسمید MIRY دارای پروموتور Pgal7 کلون شد [۳۲]. این پلاسمید شامل تعداد کپی بالایی (۱۰۰ تا ۲۰۰ در هر سلول) با ثبات میتوزی بالا تحت شرایط غیر انتخابی است [۳۳]. نمونه­های ترانسفورم شده در طی ۵ روز بدست آمدند و در محیط کشت fed-batch که دارای میزان بالایی از کوتیناز خارج سلولی در محیط کشت تخمیری شده بود رشد کردند [۳۲]. مطالعات دیگری نیز بر روی گونه های اسپرژیلوس و سرویزیه حامل دیگر پلاسمیدها نیز گزارش شده است. یک کپی از cDNA کوتیناز قارچ فوزاریوم سولانی که با الیگونوکلوئوتیدی سنتزی شروع می­ شود ساخته شده است. توالی یابی ژن کوتیناز دنبال شد با کلونینگ این ژن در پلاسمیدpUC9 که منجر به بدست آمدن این پلاسمید ناقل کوتیناز از ساکارومیسز سرویزیه SU50 و Aspergillus awamori شد [۳۴].
همچنین بازده ترشح کوتیناز گونه طبیعی (CY000) و گونه جهش یافته آبگریز (CY028) به وسیله ساکارومیسز سرویزیه SU50 مقایسه شدند. سویه CY000 قادر است تا ۲۵ میلی گرم کوتیناز در گرم (وزن خشک) را ترشح کند در حالی که سویه CY028 فقط قادر به ترشح ۲ میلی گرم در گرم می­باشد [۳۵].
از برخی گونه های اسپرژیلوس ژاپونیکا [۱۷]نیز به عنوان سلول میزبان استفاده شده ­اند، که این حاوی یک توالی DNA نوترکیب است که کد کننده کوتینازی است که با پروموتور قارچی پیوند یافته است. مشتقات سنتزی cDNA کوتیناز در Aspergillus awamori AW4-20 با بهره گرفتن از ژن پروموتور و ترمیناتور (Awamori endoxylanase II (ex1A بیان شده ­اند. اتصال ژن کوتیناز به پروموتور endoxylanase II با چهار نوع توالی متفاوت از الیگونوکلئوتید های سنتزی ساخته شده است. گونه های دارای چند کپی نسبت به گونه­ های دارای تک کپی از پلاسمید، افزایش ۶ تا ۱۲ برابری ترشح کوتیناز خارج سلولی را نشان می­دهد [۳۴, ۳۶].

 

ساختار کوتیناز

 

در سال­های اخیر ساختار کریستالی آنزیم کوتیناز از چندین میکروارگانیزم (Rhizomucor miehei , Candida antartica B, Candida rugosaPseudomonas glumae , Chromobacterium viscosum, Rhizopus delemar, Humicola lanuginose , Geotrichum candidum, Pseudomonas cepacia, Penicillium camembertii, and Pseudomonas mendaccino) و لیپاز PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران (لوزالمعده انسان) گزارش شده است. همه­ی لیپازهایی که تا کنون بررسی شده اند به طور گسترده ای از نظر اندازه و توالی اسید امینه متفاوت­اند. کوتیناز متعلق به رسته آنزیمی سرین استراز ها است و یک عضو از بالاخانواده الفا/ بتا هیدرولازها است. ساختار این آنزیم شامل بتا شیت مرکزی شامل پنج رشته موازی است که توسط دو یا سه هلیکس در دو طرف صفحه پوشیده شده است. این رشته مشابه رشته b3-b7 از تاخوردگی الفا بتا هیدرولاز و اتصال -۱×،+۲×، +۱×،+۱× است (شکل۲-۶).

شکل ‏۲‑۶ هیدرولاز آلفا و بتا [۳۷]
لیپاز یک کمپلکس کاتالیتیکی است شبیه به آنهایی که در سرین پروتئازها وجود دارند. مشخصه آنها سه اسیدآمینه سرین،هیستیدین وآسپارژین مشخص می­باشد و به وسیله یک موقعیت اتصال اکسی آنیون حالت گذار را از طریق پیوند هیدروژنی با دو گروه اصلی زنجیره آمید پایدار می­ کند.
بیشترین مطالعات بر روی کوتیناز قارچ فوزاریوم سولانی انجام شده که در E.coli کلون و بیان شده و ساختار آن با دقت Å ۶/۱ تعیین شده است [۳۸] اخیرا دقت این ساختار تا دقت Å ۱ گسترش یافته است [۳۹, ۴۰]. روش­های کریستالوگرافی که معمولا بر روی کریستال های بدست امده توسط روش انتشار بخار (vapor diffusion) انجام می­گیرد به وسیله Abergel وهمکاران شرح داده شده است [۴۱].

شکل ‏۲‑۷ ساختار کوتیناز [۱۱]
کوتیناز یک پروتئین با ۱۹۷ باقی مانده است که دارای یک دمین فشرده بوده و در اندازه۴۵ × ۳۰× ۳۰A3 است. کوتیناز با وزن مولکولی حدود ۲۲۰۰۰ دالتون صفحات بتای کشیده بسیار محافظت شده دارد که با چهار سیستئین ثابت تشکیل دو پل سولفیدی می دهند که در تمامیت ایجاد ساختار کلی نقش مهمی بازی می کند. مطالعات بیشتر بر روی ساختار اولیه نشان داده است که اختلال در این پل های دی سولفیدی به شدت ساختار و فعالیت آنزیم را تحت تاثیر قرار می­دهد به گونه­ ای که شکاف جایگاه فعال را به هم ریخته و سه­گانه کاتالیزی به اندازه کافی به منظور کاتالیز نزدیک هم قرار نمی­گیرند [۴۲].
دنباله گلیسین- تیروزین- سرین- گلوتامین- گلیسین که دارای سرین ۱۲۰ در جایگاه فعال می­باشند دارای همولوژی زیادی با توالی حفاظت شده ی گلیسین (تیروزین یا هیستیدین)- سرین-X –گلیسین دارد که معمولا در لیپاز­ها وجود دارد. سه گانه (مجموعه سه تایی) کاتالیزوری سرین ۱۲۰، آسپارژین ۱۷۵، هیستیدین ۱۸۸ (شکل۲-۹) در دسترس حلال است و به وسیله لوپ ۸۰-۸۷ و لوپ هیدروفوبی ۱۸۰ -۱۸۸ احاطه شده است [۳۹]. علاوه بر این جایگاه فعال انعطاف پذیری قابل ملاحظه ای ارائه می دهد که می تواند سازگاری با سوبستراهای مختلف را توضیح دهد [۴۰]. تا به امروز حدود ۴۰ ساختار کریستالوگرافی از کوتیناز و نمونه­های جهش یافته آن و نمونه­های متصل به ترکیبات مهارکننده تعیین شده است[۳۸, ۳۹, ۴۱, ۴۳, ۴۴].
مشخص شده است که با وجود این که کوتیناز فعالیت لیپولیتیکی دارد از لیپاز های کلاسیک متفاوت اند زیرا آنها فعالیت بین سطحی نشان نمی دهند. این پدیده برای لیپاز برای انجام فعالیت خود لازم است که علت آن وجود یک درب آبگریز در ساختار آنزیم است که جایگاه کاتالیزوری را پوشش می­دهد. به نظر می­رسد که تغییر کنفورماسیونی درب رابطه نزدیکی با روند فعال سازی بین سطحی دارد که منجر به افزایش زیادی در سطح ابگریز ­شده و به وسیله اینترکشن با بین­سطحی پایدار می­ شود [۴۴]. همچنین نتیجه حرکت درب در لیپاز تشکیل یک حفره اکسی انیونی می­باشد که در طی حمله نوکلئوفیلی به سوبسترا رخ می­دهد. این حفره اکسی انیون توسط یک گروه از دهندگان هیدروژن تشکیل می­ شود که کمک می­ کند تا اکسیژن کربونیل کاتالیزوری با بار منفی که ناشی از تشکیل کمپلکس حدواسط است پایدار شود[۴۴].
در کوتیناز لوپ های ذکر شده ۸۰-۸۷ و ۱۸۰-۱۸۸ دارای اسیدامینه های هیدروفوبیک می­باشد (لوسین ۸۱، گلیسین ۸۲ ، الانین ۸۵، لوسین -۸۶، ایزولوسین-۱۸۳، والین-۱۸۴) که ممکن است محل اتصال بین سطحی را تشکیل دهد. با وجود پل­های زنجیره جانبی از اسید امینه ها ، لوسین-۸۱ و والین -۱۸۴ و لوسین -۱۸۲ و اسپارژین – ۸۴ ، سرین کاتالیزوری کوتیناز در زیر لوپ های سطحی مدفون نشده اما برای حلال و سوبسترا در دسترس است [۳۸]. فقدان یک فلپ سرین جایگاه فعال را همانند سایر لیپاز­ها می­پوشاند و احتمالا توضیح می­دهد که چرا کوتیناز در حضور بین­سطحی فعال نیست. به نظر می­رسد که اتصال کوتیناز به بین­سطحی به باز ارایی زنجیره اصلی همانند لیپاز­ها نیاز ندارد، اما تنها جهت گیری مجدد چند زنجیره جانبی چربی دوست، به عنوان مثال لوسین-۸۱ و لوسین-۱۸۲ که نقش یک مینی فلپ را بازی می­ کنند کافی است. حضور درب برای اتصال سوبسترا مهم است و همچنین می ­تواند به ویژگی سوبسترایی مربوط شود. از ویژگی­های مهم دیگر در ساختار کوتیناز حفره اکسی آنیون تشکیل شده در کوتیناز است که به جای اینکه به وسیله­ اتصال لیگاند القا شود به نظر می­رسد که به وسیله­ زنجیره­ی جانبی سرین ۴۲ در کوتیناز تثبیت می­ شود.
زمانی که فلورسانس برای مشاهده مستقیم تشکیل تجمعات آنزیم- چربی مورد استفاده قرار گرفت به این نتیجه رسیدند که کوتیناز رفتاری مانند لیپاز به جای استراز دارد. حتی در زیر غلظت میسلار بحرانی از سوبستراهای میسلار، کمپلکس کینتیکی کوتیناز ممکن است تشکیل شود. این همچنین توضیح می­دهد که کوتیناز یک سرین در جایگاه فعال در معرض حلال دارد که می ­تواند رفتاری مشابه لیپاز فعال شده بین سطحی داشته باشد [۴۵]. اخیرا عدم فعال سازی بین سطحی در کوتیناز توسط روش رزونانس مغناطیسی هسته­ای (NMR) تایید شده است [۴۶].
یکی دیگر از ویژگی­های مهم در مورد ساختار کوتیناز حفره اکسی انیون است که زنجیره اصلی نیتروژن از گلوتامین-۱۲۱ و سرین-۴۲ در کوتیناز تشکیل شده است بدون اینکه با اتصال لیگاند تشکیل آن القا شود [۴۴]. به نظر می­رسد حفره اکسی آنیون کوتیناز به وسیله سرین-۴۲(Ser-42 Oγ) پایدار می­ شود به طوریکه جهش این سرین الانین منجر به کاهش ۴۵۰ برابری فعالیت می­ شود هر چند که در ساختار سه بعدی آنزیم به طور قابل توجهی تغییر ایجاد نشده است [۴۷]. این نتیجه تایید می­ کند که معمولا در سرین پروتئازها حفره اکسی انیون در یک فرم competent از انزیم­های بدون سوبسترا وجود دارد [۴۸]. با این وجود، مطالعات ساختاری NMR نشان داده است که رزیدوهای سرین-۴۲ و گلوتامین-۱۲۱ در مقایسه با مشاهدات انجام شده در ساختار کریستالی کاملا متحرک می­باشند [۴۹]. لذا این مطالعات یک سطحی از عدم اطمینان به فرضیه تشکیل حفره اکسی انیون ایجاد می­ کند.
به نظر می­رسد ساختار دوم کوتیناز در محلول با ساختار آن در کریستال پروتئین یکسان است [۴۶]. مطالعه ساختار کوتیناز رشد کرده است و نسبت تکنیک­های مختلف که جوانب قابل توجهی از آنزیم را شرح می­ دهند در جدول ۲-۱ خلاصه شده است.
القا انتخابی کروموفورهای آروماتیک، تریپتوفان (۲۹۶ نانومتر)، تیروزین (۲۸۰ نانومتر) آنزیم کوتیناز به منظور مطالعات فلورسانس استفاده شده است تا فهم ما را درباره جایگاه رزیدوهای اروماتیک افزایش دهند. Weisenborn و همکاران در سال ۱۹۹۶برای اولین بار بر روی فلورسانس تریپتوفان به شدت ضعیف شده در محلول ابی کوتیناز تحقیق کردند. تغییرات کنفورماسیونی در محیط­های مختلف میکرو از قبیل محلول­های آبی و در حضور SDS میسل معکوس آنیونی و سورفاکتانت­های کاتیونی دنبال شده است. فرایند­های بازشدگی موجب در دسترس قرار گرفتن تریپتوفانی که در یک منطقه نا قطبی مدفون شده است می­گردد که با تغییر حداکثر شدت فلورسانس انتشار طول موج آن ازطول موج ۳۰۳ نانومتر (محلول ابی اصلی)به طول موج ۳۳۵ نانومتر (کوتیناز دناتوره شده) نشان داده شده می­ شود.
جدول ‏۲‑۱ مطالعه ساختار- عملکرد کوتیناز به کمک تکنیک­های مختلف [۱۱]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

References Field of application Classification
Structure determination
Abergel et al., 1990; Jelsch et al., 1998;
Longhi et al., 1996, 1997a,b;